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哪些因素會影響ELISA試劑盒的實驗結果錯誤?
点击次数:311 发布时间:2019-03-25
       血浆一般可视为与血清同等的标本,标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致,ELISA試劑盒分爲內源性物質和外源性物質兩種:
1. 内源性物质
普遍认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质,可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。
(1)類風濕因子
人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合,从而导致假阳性。解决该情况的办法是:①用F(ab)2替代完整的IgG;②标本用联有热变性(63℃,10 min)IgG的固相吸附剂处理(将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效);③检测抗原时,可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中,使RF降解。
(2)補體
ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中,抗体分子发生变构,其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来,使C1q 可以将二者连接起来,从而造成假阳性。解决的办法是:①用EDTA稀释标本;②用53℃,10 min或56℃,30 min加热血清使C1q灭活。
(3)嗜異性抗體
人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体,可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,也能造成假阳性。解决的办法是:可在标本稀释液中加入过量的动物Ig (s) ,但加入量不足或亚类不同时无效。
(4)嗜靶抗原的自身抗體
抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体,ELISA試劑盒有时能与靶抗原结合形成复合物,在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。为避免以上情况出现,解决的办法是:测定前需用理化方法将其解离后再测定。
(5)医源性诱导的抗鼠Ig (s) 抗体
人ELISA試劑盒临床开展的用鼠源性CD3等单克隆抗体治疗,用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术,均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体;另外,被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig (s) 抗体。这些病人ELISA测定时均可产生假阳性。解决的办法是:测定抗原时,在标本中加入足量的正常鼠Ig (s) ,从而克服由于上述原因造成的假阳性。
(6)交叉反應物質
類di高辛、類AFP樣物質等,是與靶抗原有交叉反應的物質。在用多抗測定抗原時對測定結果影響不大,但在用單克隆抗體測定抗原時,如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應的靶決定簇時,也會出現假陽性結果。
(7)标本中其它成分的影响 血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等,均对ELISA测定结果有干扰作用。
2. 外源性物质
外源性物質常常是由于用于ELISA測定的血標本的采集、貯存不當等原因所致。如標本溶血、標本被細菌汙染、標本貯存過久、標本凝集不全和采血管中添加物等影響。
(1)標本溶血  
由于各種人爲原因引起的標本溶血,均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白,在以辣根過氧化物酶爲標記的ELISA測定中,會導致非特異性顯色,幹擾測定結果。爲克服上述幹擾作用,標本采集時必須注意避免溶血。
(2)標本受細菌汙染  
因菌體中可能含有內源性辣根過氧化物酶,因此,被細菌汙染的標本同溶血標本一樣,亦可産生非特異性顯色而幹擾測定結果。
(3)標本保存不當
在冰箱中保存過久的標本,血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體,在間接法ELISA測定中會導致本底過深、甚至造成假陽性;標本放置時間過長(如一天以上),有時抗原或抗體免疫活性減弱,亦可出現假陰性。爲克服上述幹擾,ELISA測定的血清標本宜爲新鮮采集;如不能立即測定,5天內測定的血清標本可存放于4℃,1周後測定的血清標本應低溫凍存;凍存後融解的標本,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混合後再測定,但混勻時應輕柔,不可強烈振蕩。
(4)標本凝集不全
在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下,正常血液采集後1/2~2h開始凝固,18~24h完全凝固。臨床檢驗工作中,有時爲了爭取時間快速檢測,常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清,此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結果;這類情況于次日複查時因血凝已完全,血清中不再有纖維蛋白原存在,故複查結果變爲陰性。爲避免上述幹擾作用,解決的辦法zui好是血液標本采集後必須使其充分凝固後再分離血清,或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑。
(5)人ELISA試劑盒标本管中添加物质的影响
抗凝劑(如肝素,EDTA)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA系統中辣根過氧化物酶活性)及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定幹擾作用。
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